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      PLA的工作原理

      更新時(shí)間:2023-11-21      點(diǎn)擊次數:811

      一、鄰位連接技術(shù)(PLA)的工作原理?

       Duolink®鄰位連接技術(shù)(PLA)是一種高特異性、高靈敏地原位檢測內源性蛋白、蛋白修飾和蛋白互作的強大工具.該技術(shù)可輕松檢測和定位未改造細胞和組織內單分子級別的蛋白靶標。一般先使用不同種屬來(lái)源的兩種一抗檢測兩個(gè)蛋白靶標(圖1A)。接著(zhù)用一對寡核苷酸標記的二抗(PLA探針/鄰位探針)結合一抗(圖1B)。再加入連接寡核苷酸,當一對鄰位探針足夠貼近時(shí),連接寡核苷酸會(huì )與鄰位探針對互補雜交,在連接酶的作用下形成封閉的環(huán)狀DNA,作為滾環(huán)擴增(RCA)的模板(圖1C)。接著(zhù)DNA聚合酶以PLA探針為引物,以上述環(huán)狀DNA為模板,通過(guò)RCA反應合成連環(huán)序列(圖1D)。這使仍與PLA探針相連的序列信號擴大1000倍,方便進(jìn)行信號定位。最后,用標記寡核苷酸與擴增子內的互補序列雜交(圖1E),在熒光顯微鏡下表現為散點(diǎn)(PLA信號),實(shí)現可視化和定量分析(圖1F)。Duolink® PLA技術(shù)可結合免疫熒光(即綠色、紅色、遠紅或橙色檢測)或免疫組化(即過(guò)氧化物酶催化反應)檢測貼壁細胞、細胞離心涂片和組織切片。此外,Duolink® PLA技術(shù)還可結合流式細胞術(shù)檢測血液或懸浮細胞,也可采用多孔板(例如,96384孔板)搭配高內涵篩選成像儀進(jìn)行高通量分析。Duolink® PLA 的高特異性、靈敏度和多功能性使其成為信號通路分析、藥物篩選、IC50 測定和靶標驗證的理想選擇。


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      二、DUOLINK®鄰位連接技術(shù)檢測EGFRHER2二聚化?

      表皮生長(cháng)因子受體(EGFR,ErbB1,HER1)和人表皮受體2HER2,ErbB2,Neu)的二聚化是一種蛋白質(zhì)相互作用(PPI)。EGFRHER2是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員,在細胞分裂和死亡調控中起重要作用。影響其中任意一種蛋白質(zhì)的表達或活性的突變與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。當配體(如EGF)結合EGFR的胞外結構域時(shí),EGFR受體激活并自磷酸化細胞質(zhì)尾區。從而與ErbB家族其他成員形成同源(EGFR-EGFR)和異源(例如,EGFR-HER2)二聚體(圖2)。二聚化及之后的磷酸化發(fā)生后,會(huì )募集一些銜接蛋白,進(jìn)一步激活幾個(gè)胞內信號通路,最終可調節基因轉錄,導致腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉移和抗凋亡。

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